研究成果

    人类生命过程的复杂性不只是基因直接表达的结果,更是蛋白质翻译后修饰(PTM)调节的蛋白之间动态相互作用的产物。在真核动物细胞中有近百种PTM 过程,常见的有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等。这些修饰以各种组合加诸蛋白质之上,成级数的赋予其复杂性,使蛋白质的结构更为复杂,功能更为完善,调节更为精细,作用更为专一。关于蛋白质的泛素化、可逆磷酸化及乙酰化的研究分别获得了2004 年的诺贝尔化学奖,1992 年的诺贝尔生理及医学奖和1964 年的诺贝尔生理及医学奖。研究蛋白质翻译后修饰在解析生命过程的调控机理,揭示疾病的产生原因,开发新型药物等方面都起到了至关重要的作用。迄今,至少有28种磷酸激酶的抑制剂,占肿瘤靶向治疗药物的80%,另有19 种去乙酰化酶的抑制剂用于癌症及其他疾病的临床治疗。  

刘华东教授长期进行蛋白质翻译后修饰与疾病的关系研究,在Molecular CellPNASMolecular & Cellular Proteomics等国际权威期刊发表蛋白质翻译后修饰领域及蛋白质相互作用领域高水平论文14篇,取得了以下系列突出研究成果: 

1. 破解组蛋白密码Kme解码蛋白的特异性,揭示Kme调控机理 

组蛋白尾端富含各种修饰,不同的修饰组合可以调控核小体的物理性质,并形成特异的表观遗传标记,招募特异的解码蛋白质组,实现不同功能,即组蛋白密码。例如乙酰化的H3K9Bromo结构域蛋白识别进而激活基因转录,而三甲基化的H3K9HP1蛋白识别而抑制基因转录。在这一过程中,组蛋白密码与解码结构域的结合特异性至关重要,了解解码蛋白的结合特性,是破解组蛋白密码的第一步。 

刘华东教授系统的研究了赖氨酸甲基化密码(Kme)解码结构域的结合特异性。根据phosphoplus蛋白质翻译后修饰数据库,刘华东教授合成了所有已知的组蛋白Kme密码,并且改进了多肽阵列芯片的制备方法,一步法实现了多肽纯化、定量和固定,在保证高通量的同时实现了芯片制备的高质量,为系统的破解组蛋白Kme密码提供了保障。接下来,刘华东教授利用这些多肽阵列芯片测试了各种已知的Kme 解码结构域。如图1所示,实验结果不仅验证了以前的零星报道,并且发现了大批新的特定位点Kme密码的解码蛋白。

 

1:系统的研究组蛋白Kme解码蛋白的识别特异性

          此外,刘华东教授还首次验证了H3K23me密码存在于人类组蛋白中,并利用荧光偏振技术测试了它与其解码蛋白的结合常数,通过共聚焦显微镜技术验证了H3K23me与解码蛋白HP1β在细胞内的结合。实验结果发现H3K23me和熟知的转录抑制信号H3K9me具有非常相似的结合特性,它们都会招募解码蛋白HP1βMpp8。这打破了以前公认的H3K9me-HP1β的一一对应解码模式。刘华东教授的研究为发现新的Kme 密码位点及对其功能的研究提供了成功的范例。该工作发表在Journal of Proteome Research (2010) 5827‐5836(第一作者) 

    2. 开创“非组蛋白Kme”的高通量鉴定方法,推动Kme研究发展 

尽管Kme的研究可以前推到1952 年,但一直以来人们认为这种甲基化是组蛋白特有的不可逆修饰。直到2004 年,在第一个去甲基化酶LSD1 发现之后,人们才认识到Kme也是可逆的动态调控,然而绝大多数研究仍局限于组蛋白Kme修饰领域。虽然随着时间的推移,非组蛋白中被鉴定的Kme位点逐渐增多,但是在刘华东教授的工作发表之前,由于缺少有效的鉴定方法,非组蛋白Kme位点均为偶然性报道,数据库收录的人类非组蛋白Kme 位点只有20个左右。然而人类基因编码的甲基转移酶就超过50个。根据甲基转移酶与已知Kme位点的巨大不对称性,刘华东教授推断大量的非组蛋白Kme位点还没有被发现。 

在高质量多肽阵列芯片制备的基础上,刘华东教授建立了一套从头鉴定Kme的方法,综合使用多肽阵列芯片、生物信息学和多反应检测质谱(MRM)技术,系统的鉴定非组蛋白Kme位点。首先表达Kme结合蛋白解码结构域,使用AP-MS方法鉴定其相互作用蛋白质组。由于赖氨酸在蛋白中广泛存在,不可能对结合蛋白中的赖氨酸位点进行逐一检测。因此刘华东教授先采用上述方法,利用多肽阵列芯片获得该Kme结合蛋白结构域的特异性,使用生物信息学的方法对每个位点进行评估,有效的去除90%相关性较小的赖氨酸位点,再结合LC-MRM质谱技术选择性检测可能的Kme位点,提高检测灵敏度。利用该策略,刘华东教授发现了39个非组蛋白上的Kme 位点(图2),是之前文献报道的非组蛋白Kme 位点的总和。

 

2:可以被HP1β识别的Kme位点 

该工作发表在Molecular Cell 2013, 505),723-735,(第一作者)。本策略与同期在Molecular Cell发表的Gozani教授组工作一起,创建了高通量鉴定Kme修饰的方法,推动非组蛋白Kme位点的鉴定在最近几年数量激增。目前数据库的人体非组蛋白Kme位点已超千个。现在Kme和其它常见PTM一样,被发现广泛存在于细胞的各个生命进程。这两个工作分别被Nature Protocol2014937-50)和Nature Review Molecular Cell Biology约稿专题报道。

 

由于刘华东教授策略的方法学优势,新鉴定的位点天然与用于垂钓的解码蛋白HP1β相关,为后续研究提供直接的切入点。例如,刘华东教授发现DNA 依赖性磷酸激酶(DNA‐PKcs)中的Kme 位点K1150,对HP1βDNA双链断裂(DSB)区域的募集非常重要,进而稳定激活状态DNA-PKcs的定位,揭示了HP1βDNA 双链断裂修复中的作用机理(图3)。

 

3HP1β协助DNA-PKcs定位于DNA双链断裂区域 

3. 发现乳腺癌中p53Numb诱导降解的Kme依赖机制,提供药物靶点 

作为最早发现的抑癌基因之一,p53能调节细胞周期,避免发生细胞癌变。在乳腺癌中,Numb蛋白结合p53 并导致其被降解。刘华东教授使用上述方法鉴定Numb上有两个Kme位点。该位点的甲基化使Numb丧失结合p53的能力,进而无法介导p53降解(图4)。

 

4Numb甲基化提高抑癌因子p53的水平  

接下来刘华东教授使用生物信息学的方法,成功预测了Numb甲基化位点的甲基转移酶是SET8,并利用体外甲基化-质谱鉴定的方法进行了验证。同时刘华东教授定量的分析了Numb甲基化在细胞损伤修复时的变化,为揭示Numb‐p53 结合在DNA 损伤修复中的作用奠定基础。该工作发表在Molecular Cell 2013504),565-576(第二作者)。 

4.绘制SH2-pY在免疫信号传导中的网络图谱,揭示免疫信号传递细节 

细胞上的免疫受体负责接收外界信号,并通过酪氨酸磷酸化(pY)来招募包含识别pY 的结构域(SH2)的蛋白,以实现细胞对环境的应答。然而即使在同一受体上,不同位点的磷酸化也可能导致截然不同的效果,即激活(ITAM)、抑制(ITIM)或转换(ITSM)。使用生物信息学的方法,刘华东教授预测并合成了所有人体免疫应答磷酸化位点多肽,并制备了高通量的多肽阵列芯片。同时通过表达人类基因组编码的近100GST 融合SH2蛋白,制备了高通量的蛋白质芯片。通过多肽阵列芯片、SH2蛋白质芯片与每个GST-SH2pY多肽的杂交,刘华东教授得到了全面、二维的SH2-pY 结合图谱(图5)。

 

5:细胞免疫信号传导的pY-SH2图谱 

SH2-ITAM/ITIM/ITSM图谱应用于已知信号转导通路数据库,可以标注信号通路中蛋白质的相互作用关系及具体细节。例如,在NK细胞的细胞毒性通路(hsa04650)中,该图谱指出KI2L4PIK3R2结合是因为KI2L4上的Y300 磷酸化被PIK3R2N SH2 识别的结果(图6)。更细节的免疫信号传递信息为药物设计提供潜在的特异性靶点及竞争性蛋白质结构域。该部分工作2015年发表在蛋白质组学领域高水平杂志Molecular & Cellular Proteomics上(第一作者)。

 

6NK细胞hsa04650通路中的pY-SH2免疫信号网络细节 

刘华东教授创建的双向阵列数据分析策略,克服了以前单向阵列数据只能在阵列内具有可比性的缺点。二维图谱的建立使得相互作用蛋白之间的结合强度具有双向可比性。该方法与荧光偏振技术所得的相互作用蛋白在溶液内的结合常数对比验证发现,刘华东教授的双向图谱分析与之成线性,可以可靠预测pY-SH2的结合强度。刘华东教授绘制的SH2-pY免疫信号二维图谱,不仅包含众多已知的相互作用蛋白质对,还揭示了很多新的相互作用蛋白质对,并被实验验证。利用该图谱,可以预测当受体上特定酪氨酸位点被磷酸化后招募不同SH2 蛋白的能力,并据此推断其在信号转导中起到激活、抑制还是转换的作用。该方法被Methods in Molecular Biology约稿作为系统性研究SH2-pY相互作用的标准方法之一(第一作者),如图7所示: 

7:双向蛋白-多肽阵列分析方法在PTM研究中的应用 

作为该方法的拓展应用,刘华东教授结合多肽阵列芯片和噬箘体表达的方法,实现了FYN-SH2结构域的体外快速进化。通过筛选获得特异识别不同pY位点的FYN-SH2突变体,对突变体序列的对比及结合晶体结构分析,提出FYN-SH2特异性决定序列,为特定蛋白质pY修饰的竞争性抑制剂设计打下理论基础(如图8所示,第一作者,待发表)。刘华东教授同期参与了另外一个SH2蛋白SRC的体外快速进化,并获得高广谱、高结合能力的SRC-SH2突变体superbinder,用于替代传统pY抗体检测不同肿瘤细胞系中的pY修饰差异,发表于2016年的Nature chemical biology